PCR擴增試劑盒應用前要計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設定的N個(gè)PCR反應管中分別加入15μL熒光PCR反應液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽(yáng)性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
引物是PCR特異性反應的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。
設計引物遵循的原則如下：
1.引物長(cháng)度：15-30bp，常用為20bp左右。
2.引物擴增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長(cháng)至10kb的片段。
3.引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過(guò)多易出現非特異條帶。ATGC隨機分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
4.避免引物內部出現二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會(huì )形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。
5.引物3'端的堿基，特別是末及倒數第二個(gè)堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。
6.引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴增的靶序列有適宜的酶切位點(diǎn)，這對酶切分析或分子很有好處。
7.引物的特異性：引物應與核酸序列數據庫的其它序列無(wú)明顯同源性。
8.引物量：每條引物的濃度0.1-1umol或10-100pmol，以引物量產(chǎn)生所需要的結果為好，引物濃度偏高會(huì )引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會(huì )。
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更新時(shí)間：2022-08-25
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